SDS-PAGE的工作原理是什么？

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N'-亞-CH3雙丙烯酰胺在催化劑過(guò)硫酸銨(AP)和N,N,N',N'-四-CH3乙二胺(TEMED)的作用下組成。它是一種具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠。PAGE可以根據(jù)蛋白質(zhì)分子的電荷和分子量不同而引起的遷移率不同，將蛋白質(zhì)分成若干條帶。SDS是一種陰離子表面活性劑，它可以在還原劑DTT存在下破壞蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并與蛋白質(zhì)分子按一定比例結(jié)合形成短棒狀復(fù)合物。相同的密度，與蛋白質(zhì)的分子量呈正相關(guān)，不同分子量的蛋白質(zhì)所形成的復(fù)合物的長(zhǎng)度是不同的。SDS使帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其原始電荷，掩蓋了各種蛋白質(zhì)分子之間的天然電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電泳過(guò)程中的遷移率不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只取決于相對(duì)分子質(zhì)量。

聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠通常由上層的濃縮膠和下層的分離膠組成。上下凝膠的區(qū)別在于丙烯酰胺的濃度和 Tris-HCl 的 pH 值。在電泳過(guò)程中，向凝膠施加電場(chǎng)，帶負(fù)電的蛋白質(zhì)從負(fù)極遷移到正極。最常見(jiàn)的電泳緩沖液由 Tris 和甘氨酸組成。濃縮膠中的 pH 值為 6.8，只有少數(shù)甘氨酸分子解離。因此，經(jīng) SDS 處理的蛋白質(zhì)分子在上層甘氨酸分子和下層 Cl- 離子之間移動(dòng)。這個(gè)過(guò)程將凝膠中的蛋白質(zhì)樣品壓縮成比最初加載的體積小得多的條帶。隨著電泳的進(jìn)行，蛋白質(zhì)移動(dòng)到分離凝膠（pH 8.8），甘氨酸分子在此解離，隨著運(yùn)動(dòng)速度增加而超過(guò)蛋白質(zhì)。所以，在分離凝膠中，每種蛋白質(zhì)的移動(dòng)速度取決于其分子量。分子量小的蛋白質(zhì)可以較容易地通過(guò)凝膠中的孔，而分子量大的蛋白質(zhì)則更難通過(guò)。一段時(shí)間后，蛋白質(zhì)根據(jù)大小到達(dá)不同的距離，達(dá)到蛋白質(zhì)分離的目的。

圖 1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳示意圖

如何通過(guò) SDS-PAGE 確定蛋白質(zhì)的分子量？

SDS-PAGE是測(cè)定未知蛋白質(zhì)分子量的主要方法。同時(shí)對(duì)分子量已知的蛋白質(zhì)和未知樣品進(jìn)行電泳。染色后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移率和分子量的對(duì)數(shù)，得到一條線，利用其相對(duì)遷移率確定未知樣品的分子量。在實(shí)驗(yàn)室中，用一種與染料共價(jià)偶聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)作為參考蛋白質(zhì)，粗略地指示未知蛋白質(zhì)的大小。這種預(yù)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)記可以在電泳期間或轉(zhuǎn)移膜時(shí)直接觀察到。

電泳后，肉眼無(wú)法直接觀察到蛋白質(zhì)分離，需要后續(xù)的染色技術(shù)。考馬斯亮藍(lán)染色和銀染是常規(guī)檢測(cè)和定量電泳分離蛋白質(zhì)的常用方法。經(jīng)過(guò)固定-染色-脫色等簡(jiǎn)單處理后，可以清楚地觀察到蛋白質(zhì)的分布。隨著高靈敏度蛋白質(zhì)分析方法和蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的改進(jìn)，熒光標(biāo)記、同位素標(biāo)記技術(shù)等新型染色方法的靈敏度大大提高，同時(shí)也兼容自動(dòng)化蛋白質(zhì)組平臺(tái)凝膠切割技術(shù)。開發(fā)了較高靈敏度和自動(dòng)化的染色技術(shù)。

通常在每次實(shí)驗(yàn)之前準(zhǔn)備新鮮的 SDS-PAGE 凝膠。然而，凝膠也可以在 4°C 的清水中儲(chǔ)存約一周。如果凝膠染色后不能及時(shí)拍照，則需要將其放入水中，以防止凝膠干燥和收縮。建議盡快拍攝染色結(jié)果。如果凝膠長(zhǎng)時(shí)間浸泡在水中，條帶會(huì)散開。

探究電泳實(shí)驗(yàn)過(guò)程你會(huì)發(fā)現(xiàn)，其實(shí)凝膠電泳步驟中，配制 SDS-PAGE 凝膠是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，同時(shí)也是花費(fèi)時(shí)間較多的一步。那么有沒(méi)有什么辦法可以加速這一過(guò)程呢？其實(shí)，市場(chǎng)已經(jīng)在推出預(yù)制膠，這種SDS-PAGE 凝膠是已經(jīng)配制好的，無(wú)需經(jīng)過(guò)繁瑣的制膠流程，拆了包裝就可以直接使用的。上海天能 Precast Gel預(yù)制膠不僅僅使電泳實(shí)驗(yàn)的時(shí)間縮短了30%，而且這種預(yù)制膠還采用了新型緩沖液配制技術(shù)，使電泳條帶清晰而均勻，有效避免了SDS水解或PH值不穩(wěn)定所造成的凝膠性能不穩(wěn)定，條帶不均勻等缺陷。

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