標(biāo)簽：生物反應(yīng)器 成纖維細(xì)胞  科普 胰蛋白酶 

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備和實(shí)驗(yàn)方法

1.動物和試劑

野生型 C57BL/6 小鼠。以下抗體用于免疫細(xì)胞化學(xué)：抗肌節(jié) α-肌動蛋白 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、抗心肌肌鈣蛋白 T 和抗肌球蛋白重鏈 小鼠單克隆抗體和豚鼠單克隆抗波形蛋白抗體。除非另有說明，試劑品牌選用Sigma。

2.小鼠 ES 細(xì)胞培養(yǎng)

維持在α-肌球蛋白重鏈啟動子控制下表達(dá)EGFP的小鼠ES細(xì)胞 。R1 ES 細(xì)胞普遍表達(dá) EYFP、在 α-肌球蛋白重鏈啟動子和潮霉素抗性基因上游的磷酸甘油酸激酶控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，進(jìn)行維持。

3.生物反應(yīng)器系統(tǒng)

     生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)采用使用1L左右的臺式細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器。該生物反應(yīng)器配備有溫度傳感器、PH控制系統(tǒng)、和溶氧度感應(yīng)系統(tǒng),，以及補(bǔ)料、收獲和樣品端口。數(shù)據(jù)采集及過程控制均采用微電腦自動化控制，生物反應(yīng)器內(nèi)部的空氣、氧氣或氮?dú)鈱⑷芙庋蹙S持在40%左右為宜。通過 CO 將 pH 值保持在 7.22培養(yǎng)基呈堿性時加入；當(dāng)介質(zhì)呈酸性時，不調(diào)節(jié) pH 值。溫度保持在37°C。使用帶有 CCD 相機(jī)的運(yùn)動分析顯微鏡記錄容器中 EB 的流動。也可以在 CO2 培養(yǎng)箱中使用配備不調(diào)節(jié)條件的傳感器的容器作為對照。

(上圖為：生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)基中溶解氧濃度對細(xì)胞增殖和心臟分化的影響)

4.生物反應(yīng)器培養(yǎng)

     對于檢查心臟分化功效的實(shí)驗(yàn)，我們使用 100-ml 或1L細(xì)胞罐培養(yǎng) EMG7 ES 細(xì)胞，在生物反應(yīng)器中添加 10% FBS、非必需氨基酸 (Invitrogen) 和丙酮酸鈉的格拉斯哥必需培養(yǎng)基 (Invitrogen)。胰蛋白酶消化后，將 1×10 7 個mES 細(xì)胞重新懸浮在 100 ml 分化培養(yǎng)基（1×10 5 個細(xì)胞/ml）中，并接種到 100-ml 攪拌生物反應(yīng)器中。第3天，收集培養(yǎng)在容器中的EB，在相同條件下重新接種到4個新容器中，每天*更換培養(yǎng)基（100 ml/天）或連續(xù)更換（100 ml/天）。

（下圖為：生物反應(yīng)器系統(tǒng)中葉輪攪拌速度對細(xì)胞增殖的影響）

      用于收集心肌細(xì)胞以創(chuàng)建細(xì)胞片，1×10 7使用 100-ml 或 1-L 培養(yǎng)容器培養(yǎng) R1 mES 細(xì)胞，DMEM 補(bǔ)充有 15% FBS、非必需氨基酸、丙酮酸鈉和 L-谷氨酰胺 (Invitrogen)。對于 100 ml 培養(yǎng)，第 3 天容器中的 EB 在相同條件下重新接種到 4 個新容器中，每天*更換培養(yǎng)基（100 ml/天）或連續(xù)更換（100 ml/天） ）。對于 1-L 培養(yǎng)，在第 3 天將兩個容器中的 EB 在相同條件下重新接種到 1-L 容器中，但攪拌速率除外（100-ml 培養(yǎng)，85 rpm；1-L 培養(yǎng)，65 rpm） . 連續(xù)更換培養(yǎng)基（1 L/天）。對于含有生長因子的 1-L 培養(yǎng)物，在生物反應(yīng)器培養(yǎng)開始前 3 天到后 1 天用 Noggin (150 ng/mL) 培養(yǎng)細(xì)胞，從生物反應(yīng)器培養(yǎng)的第 6 天到第 10 天用 GCSF (1 ng/mL) 培養(yǎng)細(xì)胞。在用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 解離 EB 后測量每個時間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)。對于心肌細(xì)胞的純化，從心臟分化的第 10 天到第 18 天，將 400 µg/ml G418 添加到培養(yǎng)物中。在一些實(shí)驗(yàn)中，將 R1 ES 細(xì)胞培養(yǎng)在一個類似的 100-ml 生物反應(yīng)器容器中，作為對照，在 CO2 培養(yǎng)箱中進(jìn)行調(diào)節(jié)。

（下圖為：心臟基因mRNA表達(dá)水平的比較）

5.流式細(xì)胞儀分析和熒光激活細(xì)胞分選

每個時間點(diǎn)的 EB 與 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 解離 30 分鐘，并使用流式細(xì)胞儀分析 GFP(+) 細(xì)胞的百分比。對于細(xì)胞分選，可使用流式細(xì)胞分篩系統(tǒng)進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選。EB5 mES 細(xì)胞用作陰性對照。

6.生化分析

每天從生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)收集培養(yǎng)上清液。使用生物傳感器進(jìn)行葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸的測定。

7. RNA提取和RT-PCR

下一步按照基因?qū)W實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行總 RNA 提取和 RT-PCR 。定量PCR可使用朗基Q2000B進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件為 94°C 初始變性 15 秒，而后 55°C， 30 秒和 72°C， 35 秒的 60 個循環(huán)，然后在 60-95°C 進(jìn)行熔解曲線分析。使用 GAPDH mRNA 水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相對 mRNA 表達(dá)水平。對于每個基因，所有樣品至少獨(dú)立分析 3 次。

8.免疫細(xì)胞化學(xué)

細(xì)胞用 4% 多聚甲醛固定，進(jìn)行免疫染色。再通過激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡和凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞免疫分析。

9.細(xì)胞分離

從新生小鼠（1-2 天齡）的心臟中獲得心臟成纖維細(xì)胞。來自第4代的心臟成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示>99% 的心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)波形蛋白，不表達(dá)血管性血友病因子（內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記）或 NG2（周細(xì)胞標(biāo)記）。

10.細(xì)胞接種

將從成年小鼠分離的ES細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液以3.2×10 5 個細(xì)胞/cm 2接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞在添加了15% FBS的DMEM中于37℃培養(yǎng)。培養(yǎng) 2 天后，使用細(xì)胞片堆疊操作技術(shù)收獲細(xì)胞片并分層。

11.細(xì)胞片的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析

為了觀察多層細(xì)胞片的橫截面，多層細(xì)胞片用4%多聚甲醛固定，并常規(guī)加工成3mm厚的石蠟包埋切片。通過常規(guī)方法進(jìn)行蘇木精和伊紅（HE）染色和azan染色。

12.統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過學(xué)生t檢驗(yàn)或方差分析評估組間差異，然后進(jìn)行 Bonferroni 校正以比較平均值。p <0.05的值被認(rèn)為具有靜態(tài)顯著性。

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