通過使用使用流式細(xì)胞儀可以對(duì)血小板進(jìn)行信號(hào)傳遞、細(xì)胞骨架 架構(gòu)、糖蛋白結(jié)構(gòu)、血小板活化反應(yīng)， 糖蛋白缺陷檢測(cè)， RNA含量，血小板抗體等分析檢測(cè)。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行血小板分析檢測(cè)時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)：
一)抗體的選擇
選擇CDWorkshop中的單克隆抗體.單克隆抗體反應(yīng)特異性高,非特異性結(jié)合少,
但由于血小板富含F(xiàn)cRⅡ(CD32,Fe Ⅱ受體),而Fc受體對(duì)不同抗體亞類具有不同親和力,所以在業(yè)類選擇上,對(duì)于人的抗體以選擇IgG1為好.
二)抗凝劑的選擇
盡量避免使用肝素;EDTA在室溫20~25℃時(shí)其抗凝效果與枸椽酸鹽無差別,但在37℃時(shí),EDTA就會(huì)影響蛋白結(jié)構(gòu)及刺激血小板活化.
三)標(biāo)本的采集
般采少量外周血,收集在玻璃容器或塑料容器中,采血中避免組織液流人血液中;防止氣泡產(chǎn)生;并使用大號(hào)針頭(如18號(hào)).盡量減少化學(xué)、物理的激活因素對(duì)血小板的活化作用.標(biāo)本的放置溫度以15-25℃為宜,4~10℃以下血小板的外形發(fā)生改變.
四)抗體標(biāo)記物的選擇
我們知道,FITC和PE標(biāo)記是常用的在488nm激發(fā)下作為雙標(biāo)記使用的試劑,PE的熒光強(qiáng)度比FITC強(qiáng).因?yàn)樵谟脝紊珳y(cè)定中CD62p和CD63在靜止血小板上均為弱表達(dá),檢測(cè)這兩個(gè)抗原時(shí)用PE標(biāo)記為宜.而當(dāng)CD62p和CD63配合一個(gè)高強(qiáng)度表達(dá)的抗原CD41、CD61或CD42b作為雙標(biāo)記時(shí),CD62p和CD63卻宜使用FITC標(biāo)記.
五)樣品固定
使用流式細(xì)胞儀同樣可以檢測(cè)樣本中的血小板反應(yīng)力及活化進(jìn)程；樣本的固定的主要目的為了減少血小板的體外活化,在進(jìn)行樣本固定時(shí)，也可能會(huì)破壞部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),從而增加非特異性染色.所以,除了做體外剌激血小板活化研究和不能及時(shí)處理標(biāo)本外,都應(yīng)該做標(biāo)記之后再固定.樣本固定劑一般使用0.5%~1.0%的多聚甲醛即可.
六)緩沖液
在孵育和洗滌過程中經(jīng)常會(huì)使用PBS(0.01 mol/LpH7.2)+BSA.但如果是分析血小板活化過程，由于Tyrode緩沖液中主要含有鎂離子和grape sugar,這兩種物質(zhì)有利于減少血小板的體外活化。所以在洗滌的時(shí)候,也可以使用Tyrode緩沖液。
七)儀器的設(shè)置
部分的流失細(xì)胞儀需要利用熒光微球微球進(jìn)行儀器光路和光電信號(hào)的控制,使儀器保持相對(duì)穩(wěn)定、靈敏的狀態(tài).當(dāng)數(shù)據(jù)采集完成以后,散射光和熒光需要使用對(duì)數(shù)放大,這時(shí)通過調(diào)節(jié)散射光電壓,使細(xì)胞群分布盡量保持在中間位置.調(diào)節(jié)熒光電壓,使樣品繼發(fā)熒光強(qiáng)度落在對(duì)數(shù)值1內(nèi),也可以使用熒光微球或者使用CD4-FITC/CD8-PE雙色標(biāo)記單抗來做熒光補(bǔ)償.標(biāo)本至少分析5000個(gè)細(xì)胞,而且每秒流速不宜超過1000~1500個(gè)細(xì)胞.
八）數(shù)據(jù)分析
在活化血小板(CD62p、CD63)等少量表達(dá)抗原的檢測(cè)中,閾值的設(shè)定一般是使非特異性染色的比例控制在1%~2%的范圍內(nèi),但要對(duì)非特異性染色進(jìn)行正確的設(shè)定依靠?jī)x器的敏感度及試劑的質(zhì)量.當(dāng)測(cè)定的抗原本身為高表達(dá)而要判斷抗原表達(dá)的高低度時(shí),需要依據(jù)平均熒光強(qiáng)度。
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