人腸道類器官作為一種在體外高度模擬人體腸道結(jié)構(gòu)和功能的三維模型，在疾病建模、藥物篩選、宿主-微生物互作及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。其成功構(gòu)建的基石在于能否高效、穩(wěn)定地從腸道組織中分離出具有干性的隱窩基干細(xì)胞。本文系統(tǒng)性地總結(jié)人腸道類器官構(gòu)建過程中，從組織獲取到干細(xì)胞分離、最終形成類器官的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)、常見問題及解決方案，為相關(guān)研究提供實(shí)踐參考。

   腸道上皮是一個(gè)持續(xù)更新的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，其再生能力源于位于腸隱窩基底部的Lgr5+腸道干細(xì)胞。2009年，Clevers團(tuán)隊(duì)開創(chuàng)性地在體外利用單個(gè)Lgr5+干細(xì)胞成功培育出具有隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)的腸道類器官，標(biāo)志著該領(lǐng)域的重大突破。這一技術(shù)的核心在于：從人腸道組織中分離出完整的隱窩單元或活性干細(xì)胞，并將其置于能模擬體內(nèi)干細(xì)胞巢（Niche）的基質(zhì)膠中，提供必需的生長因子信號(hào)。

一、 技術(shù)流程與核心要點(diǎn)

整個(gè)流程可大致分為：組織前處理、隱窩/干細(xì)胞分離、類器官培養(yǎng)與傳代。每一步的精細(xì)操作都直接影響最終的成敗。

1. 組織樣本的前處理與準(zhǔn)備

技術(shù)要點(diǎn)：

• 樣本來源與運(yùn)輸： 樣本可來源于手術(shù)切除的健康或病變腸段、內(nèi)鏡活檢組織。關(guān)鍵在于保持組織活性。離體后應(yīng)立即置于預(yù)冷的（4°C）組織保存液（如含有高濃度抗生素的Advanced DMEM/F12）中，并在最短時(shí)間內(nèi)（建議<24小時(shí)）進(jìn)行處理。冰上操作以降低代謝。

• 組織清洗與修剪： 用含有多重抗生素（如青霉素/鏈霉素、慶大霉素、兩性霉素B等）的PBS或Advanced DMEM/F12充分沖洗，直至清洗液清澈，以去除黏液和內(nèi)容物。隨后，使用精細(xì)解剖工具小心去除腸壁的肌肉層和脂肪組織，僅保留黏膜層。這一步能極大減少后續(xù)的微生物污染和成纖維細(xì)胞過度生長。

• 黏膜剝離： 將修剪后的黏膜組織剪成約0.5 cm2的小塊，便于后續(xù)消化。

2. 隱窩與干細(xì)胞的分離

這是整個(gè)流程中最關(guān)鍵、技術(shù)性的環(huán)節(jié)，主要方法有化學(xué)消化法和物理分離法。

A. 化學(xué)消化法（常用）

• 原理： 利用螯合劑和酶選擇性解離細(xì)胞間連接，釋放隱窩結(jié)構(gòu)。

• 關(guān)鍵試劑： EDTA (乙二胺四乙酸) 是核心。它通過螯合Ca2?和Mg2?，破壞依賴于二價(jià)陽離子的細(xì)胞黏附分子（如E-cadherin），從而松解隱窩單元。

• 標(biāo)準(zhǔn)流程與要點(diǎn)：

1. EDTA孵育： 將組織碎片置于含2-30 mM EDTA的PBS溶液中（常用濃度為5-10 mM），在4°C下緩慢搖動(dòng)孵育30分鐘至2小時(shí)。低溫孵育有助于溫和解離，減少對(duì)干細(xì)胞的損傷。

2. 機(jī)械震蕩： 孵育后，用力搖晃試管或使用大口徑吸管反復(fù)吹打。此時(shí)，隱窩應(yīng)從黏膜上脫落，懸液變得渾濁。

3. 洗滌與收集： 使用預(yù)冷的PBS或基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞懸液，通過100 μm細(xì)胞篩過濾以去除大塊組織。濾液需再次通過40 μm細(xì)胞篩，此時(shí)完整的隱窩（通常>40 μm）會(huì)被截留在篩網(wǎng)上，而單個(gè)細(xì)胞和碎片則被濾除。

4. 顯微鏡下確認(rèn)： 收集40 μm篩網(wǎng)上的物質(zhì)，重懸后于倒置顯微鏡下觀察。成功的分離應(yīng)看到大量形態(tài)完整、呈“花瓶狀"或“戒指狀"的隱窩結(jié)構(gòu)，輪廓清晰，內(nèi)部細(xì)胞緊密。碎片和單個(gè)細(xì)胞應(yīng)盡可能少。

B. 隱窩富集與純化

• 目的： 進(jìn)一步提高隱窩的純度，去除殘留的單個(gè)細(xì)胞（多為分化的上皮細(xì)胞或免疫細(xì)胞）和死細(xì)胞。

• 技術(shù)：

• 自然沉降法： 利用隱窩與單個(gè)細(xì)胞沉降速度的差異，將細(xì)胞懸液靜置于冰上5-10分鐘，小心吸取上清（含較多單個(gè)細(xì)胞和碎片），重復(fù)2-3次。

• 密度梯度離心法： 使用如Percoll等密度梯度離心介質(zhì)，可以更精細(xì)地分離出高純度的隱窩。

3. 類器官的培養(yǎng)與維持

技術(shù)要點(diǎn)：

• 基質(zhì)膠包埋： 將收集到的隱窩與預(yù)冷的基質(zhì)膠（如Matrigel®或Cultrex BME）充分重懸。關(guān)鍵：所有操作必須在冰上進(jìn)行，以防止基質(zhì)膠提前聚合。 

• 以每滴20-50 μL的體積將膠滴加至培養(yǎng)板孔中，隨后在37°C下孵育15-30分鐘，使其固化。

• 類器官培養(yǎng)基： 在固化的基質(zhì)膠上覆蓋富含生長因子的類器官培養(yǎng)基。核心生長因子組合包括：

• Wnt3a： 維持干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵信號(hào)。

• R-spondin 1： 增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路。

• Noggin： BMP信號(hào)通路抑制劑，促進(jìn)隱窩形態(tài)發(fā)生。

• EGF： 刺激上皮細(xì)胞增殖。

• 此外，還需添加B27、N2等補(bǔ)充劑，以及如Gastrin、Nicotinamide等小分子。

• 培養(yǎng)環(huán)境： 置于37°C、5% CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基需每2-3天更換一次，以保持生長因子活性和營養(yǎng)供給。

4. 類器官的傳代與擴(kuò)增

當(dāng)類器官生長至中心區(qū)域變暗、充滿細(xì)胞時(shí)（通常培養(yǎng)后5-10天），需要進(jìn)行傳代。

• 消化： 使用機(jī)械吹打或溫和的消化酶（如Accutase、TrypLE）將類器官和基質(zhì)膠消化成單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)塊。

• 重懸與再鋪板： 將消化后的細(xì)胞懸液按適當(dāng)比例（通常1:3至1:6）與新的基質(zhì)膠混合，開始新一輪的培養(yǎng)。

二、 常見問題與優(yōu)化策略

高效分離具有完整功能的人腸道干細(xì)胞是成功構(gòu)建類器官的前提。掌握從組織處理、EDTA溫和消化到隱窩純化等一系列關(guān)鍵技術(shù)細(xì)節(jié)，是獲得高活性、高純度干細(xì)胞群的決定性因素。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，如利用流式細(xì)胞術(shù)或特定的實(shí)驗(yàn)室儀器分選特定標(biāo)志物（如CD24, CD44）的干細(xì)胞亞群，或通過非整合性重編程手段獲得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來源的腸道類器官，將進(jìn)一步拓寬該技術(shù)的應(yīng)用邊界。對(duì)技術(shù)要點(diǎn)的深刻理解和不斷優(yōu)化，將是推動(dòng)人腸道類器官技術(shù)在基礎(chǔ)研究與科研應(yīng)用中發(fā)揮更大價(jià)值的關(guān)鍵。