外泌體通常被認為是細胞間信號分子，包含許多蛋白質(zhì)、核酸、細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和其他細胞來源的顆粒。外泌體不僅可以向局部環(huán)境傳遞信息，還可以向距離很遠的細胞和組織傳遞信息。這可能作為一般信號和通信通路，但也可能參與致癌基因擴散和惡性腫瘤進一步惡化。迄今為止，已證實外泌體存在于體液中，例如羊水、血清、母乳、附睪液、唾液、尿液、腹水和胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液、滑液和體外細胞培養(yǎng)上清液中 。細胞排出的外泌體也可作為去除不必要的蛋白質(zhì)和核酸的一種方式，例如，在細胞成熟（網(wǎng)織紅細胞）或排泄系統(tǒng)（腎的內(nèi)臟和小管 ）期間的外泌體。

     為了正確使用外泌體作為 DDS，我們必須考慮外泌體的成分和它們的形成途徑。然后，還應(yīng)描述外泌體親和力和細胞攝取的特征。外泌體載體表現(xiàn)出不同的目的和功能，這要歸功于外泌體作為基本的轉(zhuǎn)運體本身就具有出色的特性。這可以用于細胞靶向，也可以作為藥物的額外增強。迄今為止，ExoCarta 在外泌體中發(fā)現(xiàn)了大約 10,000 種蛋白質(zhì)、3500 種 mRNA 和超過 1100 種不同的脂質(zhì)。 對于系統(tǒng)審查，出現(xiàn)了許多很棒的數(shù)據(jù)庫，例如Vesiclepedia和 ExoCarta，其中描述了外泌體分離程序和來源以及已識別的載體.
     外泌體蛋白質(zhì)特征是:膜結(jié)合四跨膜蛋白（CD9、CD63、 CD81 和 CD82），以及常規(guī)用于分離的 EpCAM 和 Rab5 。其他蛋白質(zhì)是受體（CD46 和 CD55）、熱休克蛋白（HSP ；Hsc70、Hsp70 和 Hsp90）、參與外泌體形成的蛋白質(zhì)（ Alix、TSG101）和負責(zé)融合和轉(zhuǎn)運的膜蛋白（GTP 酶、膜聯(lián)蛋白和 flotillin；ATP7A、ATP7B、MRP2  、SLC1A4 、SLC16A1 和 CLIC1)等。使用 ELISA法檢測這些標(biāo)記蛋白可以用于確認外泌體的存在。
     也有相關(guān)研究稱外泌體含有其他顆粒，如膽固醇（B 淋巴細胞來源）、鞘脂、磷酸甘油酯和神經(jīng)酰胺等。外泌體還運輸形態(tài)發(fā)生素（Hedgehog、 Wingless 和 Wingless-like），參與黑腹果蠅所描述的組織模式發(fā)育。
         核酸是在外泌體中發(fā)現(xiàn)的另一組主要顆粒，即 DNA 和 RNA，它們可以在細胞中發(fā)揮功能作用。在源自小鼠和人類肥大細胞的外泌體中發(fā)現(xiàn)了約 1300 種 mRNA、121 種 miRNA 和 >100 種小 RNA，但未檢測到 DNA 和 rRNA 。 在外泌體中發(fā)現(xiàn)的其他 miRNA 是 lin-4 和 let-7 ，以及母乳中的 miR-181a 和 miR-155。

一些外泌體 miRNA 可用作診斷中的生物標(biāo)志物（ 表 2）。

小鼠外泌體對人類細胞的刺激可以導(dǎo)致人類細胞中小鼠蛋白質(zhì)的合成。此外，外泌體和受體細胞的 mRNA 譜不同，表明 mRNA 被主動分選為 MVB。
外泌體的分離方法
目前，有許多可用的外泌體分離方法（ 表 1）。比較傳統(tǒng)的外泌體分離方法是超速離心，許多人將其視為金標(biāo)準(zhǔn)。其他技術(shù)主要基于大小排阻或抗體介導(dǎo)的標(biāo)記外泌體分離。每種分離方法在純度、數(shù)量、效率和通量方面都不同。超速離心法分離法 的缺點是外泌體結(jié)構(gòu)容易發(fā)生改變，造成外泌體的結(jié)構(gòu)不一致性甚至?xí)?dǎo)致外泌體受損。
表 1. 外泌體分離方法。

1.超速離心法：
   超速離心基于顆粒的大?。ㄖ亓浚┘捌湓陔x心力（100,000–110,000× g）下的離心沉降。至于去除的細胞碎片和不需要的顆?？梢酝ㄟ^稱為差速離心的幾步慢速離心來獲得。外泌體的純化可以采用蔗糖梯度密度離心純化法：即：在蔗糖梯度 (1.13–1.19 g/mL) 或緩沖液中進行，以實現(xiàn)更高的富集、產(chǎn)量和純度增加。 
2.超濾法：
   超濾法使用的是微孔過濾器；因此，較大的顆粒將從濾液中排除。它可以與離心結(jié)合使用，通過初步去除細胞碎片等大顆粒來加速外泌體的純化。不過使用此方法需要防止孔隙堵，不適合大規(guī)模的樣本處理。
3.尺寸排阻層析法
    尺寸排阻層析法也被稱為凝膠過濾層析法，這種方法是基于凝膠孔的大小和外泌體的大小，大于凝膠孔徑的顆粒被洗脫；反之，小于凝膠孔徑的顆粒將被抑制。凝膠過濾層析 分離法總體上能獲得較高的純度和產(chǎn)量。建議與超濾相結(jié)合，這種方法可提供更少的蛋白質(zhì)污染和更高的外泌體回收率。 凝膠過濾層析分離法的缺點是凝膠的成本過高。
4.沉淀分離方法：
   基于聚合物的沉淀分離方法是利用超親水聚合物來增強小尺寸顆粒（如外泌體）的沉淀。聚乙二醇的常用濃度在 8% 到 15% 之間變化。使用這種方法，將含有外泌體的溶液與聚合物一起孵育過夜，并在約 10,000× g下進一步離心。
5.免疫學(xué)分離方法
   免疫學(xué)分離法是利用受位于外泌體膜中的選定蛋白質(zhì)標(biāo)記物影響的抗體對外泌體進行標(biāo)記。這些標(biāo)記的外泌體可以進一步輕松處理和純化，例如，使用微芯片或磁珠。磁分離后，外泌體被純化，磁珠被溶解和去除。通過這種簡單快速的方法，就可以獲得較高純度提取物，但不會分離出缺乏磁性標(biāo)記抗體識別的表面標(biāo)記的外泌體，這可能導(dǎo)致外泌體池表現(xiàn)效果 不佳。這種方法雖然既省時又直接，輸出純度較高，但也需要較為昂貴的試劑。
6.親和層析分離法
在親和層析分離法方面，主要使用凝集素和合成 Vn (venceremin) 肽。凝集素將結(jié)合存在于外泌體表面的糖基化蛋白質(zhì)，從而使 外泌體沉淀。Vn 肽分離技術(shù)基于其對含有 HSP 的細胞外顆粒的高親和力。然而，這種方法比較容易使提取物被膜表面上含有上述標(biāo)記物的細胞和其他顆粒污染。
7.微流控分離法
  微流控分離法主要是在微芯片上進行的，這里我們需要提及的是，微流控分離法法可用于外泌體分離（免疫結(jié)合和磁結(jié)合、過濾），效率相對較高（約 90%）。
8.FFF分離法
  FFF 目前是一種很少使用但前景不錯的一種外泌體分離方法。分離由橫流力驅(qū)動，并基于顆粒的分子量或流體動力學(xué)直徑。它包括高純度、高效率和短時間處理，但迄今為止，F(xiàn)FF 在外泌體分離中的使用案例較少 ，還有待進一步開發(fā) 。
9.聲學(xué)流體分離
   聲學(xué)流體分離技術(shù)利用聲場根據(jù)粒子的大小、密度和可壓縮性來分離粒子。生物樣品在此過程中不會受到損壞，并且分離的本身是非接觸式、高效的和無標(biāo)記的。
10.納米粒徑分析法
   確定性橫向位移依賴于顆粒流動路徑的變化，而顆粒流動路徑取決于顆粒尺寸。這種方法雖然比較簡單，但是需要使用掃描電鏡技術(shù)、動態(tài)光散射技術(shù)、納米粒子跟蹤分析技術(shù)、單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）技術(shù)等。對于外泌體大小、形態(tài)、外泌體的 濃度、zeta電位等分析也可以使用Nanocoulter粒度分析儀。


11.介電泳分離法：
介電泳分離法主要利用不同大小的粒子在不均勻電場中的位置差異。外泌體被吸引到高電區(qū)域，而較大的顆粒將位于低電區(qū)域。該方法速度快，適合用于高通量篩選，但缺點是需要加熱。
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